Исследовав трехмерную структуру рибосомной РНК современных бактерий, канадские биохимики из Монреальского университета (Département de Biochimie, Université de Montréal) пришли к выводу, что рибосомы могли сформироваться в результате постепенной эволюции из очень простой маленькой молекулы РНК — «проторибосомы», способной катализировать реакцию соединения двух аминокислот. Все остальные структурные блоки рибосомы последовательно добавлялись к проторибосоме, не нарушая ее структуру и постепенно повышая эффективность ее работы.

Рибосомы у всех живых существ — от бактерий до человека — устроены очень похоже. По-видимому, это означает, что рибосомы в их «современном» виде имелись уже у общего предка всех нынешних форм жизни (см. LUCA, Last universal common ancestor). Рибосома состоит из двух субъединиц — большой (главной) и малой (вспомогательной). Основу обеих субъединиц составляют молекулы рибосомной РНК (рРНК). Снаружи к молекулам рРНК прилегают молекулы рибосомных белков.

Согласно общепризнанной в настоящее время теории «РНК-мира», на ранних этапах развития жизни все основные функции, которые сегодня выполняются белками, выполнялись молекулами РНК. Появление системы синтеза белка на основе записанных в РНК «инструкций» стало ключевым событием, ознаменовавшим переход от «мира РНК» к привычному нам «белковому миру». Поскольку рибосомы являются центральным компонентом этой системы, вопрос о происхождении рибосом чрезвычайно важен для понимания того, как РНК-организмы превратились в первые прокариотические клетки.

До сих пор многим экспертам казалось, что загадка происхождения рибосом вряд ли когда-нибудь будет разгадана. Ведь в природе не осталось никаких «переходных звеньев», то есть более простых молекулярных комплексов, которые могли бы претендовать на роль «предков» рибосом. Однако канадские биохимики, похоже, нашли ключик к этой тайне в самой структуре рибосом современных организмов.

Они сосредоточились на самой главной части рибосомы — на молекуле 23S-рРНК, которая представляет собой основу большой субъединицы рибосомы кишечной палочки (Escherichia coli ). Эта молекула весьма велика: она состоит почти из 3000 нуклеотидов. В клетке она сворачивается в сложный трехмерный «клубок». Разные петли, выступы и другие элементы структуры этого «клубка» обеспечивают выполнение разных функций: связь с рибосомными белками, присоединение малой субъединицы, присоединение и удерживание в нужных позициях молекул транспортных РНК (тРНК), которые несут на своих «хвостиках» (CCA-3"-концах) аминокислоты, необходимые для синтеза белка.

Ранее уже было показано, что рибосомные белки играют в рибосоме вспомогательную роль: они делают ее более стабильной и повышают эффективность ее работы, однако все главные действия, необходимые для синтеза белка, осуществляются не белками, а рибосомными РНК. Это значит, что изначально рибосомы могли состоять только из рРНК, а белки добавились позже. Самый главный этап трансляции — присоединение аминокислот к синтезируемой белковой молекуле (реакция транспептидации) — осуществляется молекулой 23S-рРНК. Поэтому логично предположить, что всё началось именно с этой молекулы.

Однако молекула 23S-рРНК слишком велика и сложна, чтобы появиться в готовом виде в результате случайного комбинирования нуклеотидов. Таким образом, ключевой вопрос состоит в том, могла ли 23S-рРНК произойти от более простой молекулы-предшественницы в результате постепенной эволюции, то есть путем последовательного добавления новых фрагментов. Главный вывод обсуждаемой статьи заключается в том, что структура 23S-рРНК свидетельствует именно о таком ее происхождении.

Молекула 23S-рРНК состоит из шести основных структурных блоков, или доменов. Каждый домен, в свою очередь, состоит из более мелких структурных единиц. Целостность трехмерной структуры молекулы поддерживается разнообразными связями (в основном водородными) между ее участками. Некоторые участки молекулы сворачиваются в двойные спирали на основе принципа комплементарности . Важную роль играют и так называемые «А-минорные» связи. А-минорная связь возникает между последовательностью из нескольких идущих подряд аденозинов (А) в одной части молекулы и двойной спиралью в другой ее части (см. рис. 2).

Исследуя структуру 23S-рРНК, авторы обратили внимание на следующее странное обстоятельство. Двойные спирали и образующие с ними А-минорные связи «стопки» аденозинов (adenosine stacks) распределены по шести доменам молекулы более или менее хаотично, за единственным исключением: в пятом домене наблюдается необычное скопление двойных спиралей и практически нет аденозиновых «стопок». Таким образом, А-минорные связи, образуемые пятым доменом, являются однонаправленными (см. рис. 3).

Это наблюдение навело авторов на мысль, что эволюция молекулы 23S-рРНК могла начаться с домена V или с какой-то его части. Дело в том, что А-минорные взаимодействия необходимы для поддержания стабильной трехмерной структуры той части молекулы, к которой принадлежит аденозиновая «стопка», но они не влияют на стабильность той ее части, к которой принадлежит двойная спираль. Иными словами, если мы разорвем какую-нибудь А-минорную связь, показанную на рис. 3 голубой линией, это нарушит структуру той части молекулы, где находится желтый кружок, но не причинит вреда той части, где расположен красный кружок. Таким образом, если 23S-рРНК развивалась постепенно из простой молекулы-предшественницы, то сначала должны были появляться двойные спирали (красные кружки), и только потом к ним могли «пристраиваться» аденозиновые стопки (желтые кружки).

Но если пятый домен был той «затравкой», с которой началась эволюция 23S-рРНК, то следует ожидать, что именно в этом домене находится какой-то важный функциональный центр молекулы. Так ли это? Оказывается, это действительно так: именно пятый домен играют ключевую роль в транспептидации. Он удерживает в правильных позициях CCA"-хвосты двух молекул тРНК (той, что принесла предыдущую аминокислоту, уже присоединенную к синтезируемому белку, и той, что принесла следующую аминокислоту, см. рис. 1). Именно пятый домен 23S-рРНК обеспечивает сближение новой аминокислоты с предыдущей, уже присоединенной к белку, и катализирует соединение аминокислоты с белком.

Обнаружив эти факты, исследователи перешли к более тонкому анализу структуры 23S-рРНК. Они подразделили молекулу на 60 относительно самостоятельных структурных блоков и детально проанализировали характер связей между ними. Фактически они рассматривали молекулу как сложный трехмерный «пазл» и пытались выяснить, поддается ли он сборке и разборке без поломки деталей. Оказалось, что молекулу действительно можно постепенно «разобрать», ни разу не нарушив структуру остающихся блоков. Сначала можно отделить 19 блоков, причем структура оставшихся блоков остается неповрежденной. После этого отделяются еще 11 блоков, затем еще 9, 5, 3, 3, 2, 2, 2; наконец, еще три блока можно отделить последовательно по одному. После этого остается «неразобранным» лишь маленький фрагмент молекулы, составляющий 7% от ее общей массы. Этот неразобранный фрагмент представляет собой участок пятого домена, содержащий в себе каталитический центр, ответственный за транспептидацию (пептидил-трансферазный центр, PTC, peptidyl-transferase centre).

Возможность последовательной разборки молекулы без повреждения остающихся частей — факт весьма нетривиальный. Все блоки молекулы связаны друг с другом, причем связи эти имеют направленный характер: при их разрыве один блок повреждается, а другой нет. Можно представить систему блоков и связей между ними как множество точек, соединенных стрелками, причем стрелка будет указывать на тот блок, который повреждается при разрыве связи. Если бы эти стрелки образовали хотя бы одну кольцевую структуру (иными словами, если бы мы, двигаясь из какой-то точки по стрелкам, могли вернуться в ту же точку), то разобрать молекулу без повреждения остающихся частей было бы невозможно. Однако ни одной такой кольцевой структуры в молекуле 23S-рРНК не обнаружилось. Если бы направление связей было случайным, вероятность отсутствия кольцевых структур составляла бы менее одной миллиардной. Авторы делают вывод, что это вряд ли результат случайности. По-видимому, структура связей между блоками молекулы отражает последовательность добавления этих блоков в ходе постепенной эволюции молекулы.

Получается, что исходной функциональной молекулой — «проторибосомой», с которой началась эволюция рибосомы, — был пептидил-трансферазный центр (PTC) пятого домена молекулы 23S-рРНК. Сам PTC состоит из двух симметричных лопастей. Каждая лопасть удерживает CCA"-хвостик одной молекулы тРНК. Логично предположить, что такая структура возникла в результате дупликации (удвоения) одной исходной лопасти.

Могла ли такая «проторибосома», способная удерживать две молекулы тРНК и сближать в пространстве прикрепленные к ним аминокислоты, выполнять какую-то полезную функцию в РНК-организме? Эксперименты позволяют ответить на этот вопрос утвердительно. Методом искусственной эволюции были получены функциональные РНК (рибозимы), способные катализировать транспептидацию (соединение аминокислот, прикрепленных к тРНК, в короткие белковые молекулы). Структура этих искусственно выведенных рибозимов очень близка к структуре той проторибосомы, которую «вычислили» авторы обсуждаемой статьи.

По-видимому, проторибосома была просто устроенным рибозимом, катализирующим синтез небольших белковых молекул в РНК-организме. Специфичность синтеза поначалу была очень низкой (аминокислоты выбирались более или менее случайно). В дальнейшем к проторибосоме добавлялись новые блоки, причем добавлялись они таким образом, чтобы не нарушить структуру активного центра молекулы, а также всех тех блоков, которые присоединились ранее. Если очередная мутация приводила к нарушению уже сложившихся структур, она отсеивалась отбором.

Авторы детально реконструировали предполагаемый процесс постепенной эволюции 23S-рРНК. Первые восемь дополнительных блоков присоединились к проторибосоме таким образом, что образовали нечто вроде массивного «основания», благодаря которому структура проторибосомы стала гораздо более стабильной. Следующие 12 блоков еще более укрепили и расширили это «основание». Новые блоки образовали поверхность контакта с малой субъединицей, что позволило включить ее в состав рибосомы. В числе последних добавились блоки, образующие особые выросты (protuberances) на поверхности большой субъединицы. Функция этих выростов состоит в том, что они помогают рибосоме выбирать «правильную» тРНК, несущую нужную аминокислоту, а также выпускать из рибосомы «отработанные» тРНК. В итоге проторибосома оказалась окружена другими блоками со всех сторон, за исключением канала, который был оставлен для выхода образующейся белковой цепочки.

Таким образом, 23S-рРНК, при всей ее кажущейся сложности, построена на основе довольно простого принципа. Ее блочная структура свидетельствует о том, что она могла довольно быстро развиться в ходе эволюции из проторибосомы под действием мутаций и отбора.

Авторы предполагают, что переход от РНК-мира к «белковому миру» состоялся после этапа, обозначенного буквой b на рис. 5. Дело в том, что те блоки рибосомы, которые показаны на рис. 5b, не контактируют с рибосомными белками. Они могли развиться еще до того, как у РНК-организма появилась возможность синтезировать белки с такой точностью, чтобы некоторые из этих белков могли пригодиться для укрепления и усовершенствования рибосом. Все остальные блоки рибосомы (начиная с рис. 5c) уже находятся в тесном контакте с рибосомными белками и «нуждаются» в них для поддержания своей стабильности. Вероятно, они добавлялись уже в «белковом мире», и их эволюция была изначально сопряжена с эволюцией белков.

Большинство биохимических и биофизических экспериментов позволяют измерить какую-либо величину лишь «в среднем по палате», не достигая чувствительности, необходимой для регистрации событий на уровне отдельных молекул. Однако в последнее время всё большее распространение получают методики наблюдения за молекулами по отдельности . Недавно подобная технология была использована для «подглядывания» за работой отдельной рибосомы в реальном времени, наглядно выстраивая в цепочку события, происходящие при синтезе белковой молекулы.

Эксперимент был основан на регистрации флуоресцентного сигнала с отдельных молекул тРНК, меченных различными флуоресцентными красителями (методика резонансной миграции энергии флуоресценции, FRET), что позволяет в реальном времени наблюдать присоединение той или иной тРНК, а, значит и «видеть» весь процесс трансляции. Всё действо проходит в чрезвычайно маленьких (можно сказать, по размеру рибосомы) резервуарах - безмодовых волноводах (рис. 1), которые получают распространение и в других «одномолекулярных» задачах (например, секвенировании одиночных молекул ДНК).

Рисунок 1. Наблюдение за работой отдельной рибосомы. Основой всего эксперимента является безмодовый волновод - тончайшая алюминиевая плёнка с перфорацией радиусом 50–200 нм и прозрачной подложкой (исследователи контролировали, чтобы на донышке «лунки» закреплялось ровно по одной рибосоме). При столь малом диаметре и объёме всего 10 −21 л (зептолитр!) становится возможным «отсеивать» фоновую флуоресценцию и сосредоточиться на происходящем именно в этой «лунке». Последовательное связывание на рибосоме флуоресцентно меченных молекул тРНК порождает последовательность цветных вспышек, содержащую в себе подробную информацию о чередовании тРНК и о ходе трансляции в целом.

В модельных экспериментах наблюдали за синтезом пептидов длиной 4–13 аминокислотных остатков, причём концентрации тРНК и кофакторов элонгации были эквивалентны естественным (на уровне микромоль, что в десятки раз выше, чем удавалось использовать ранее). Варьирование этих концентраций пропорционально меняет скорость синтеза белкá, максимальный уровень которой - около одного кодона в секунду - достигается при физиологических значениях концентраций тРНК и фактора элонгации EF-G (рис. 2). Регистрация флуоресценции позволяет наблюдать за особенностями протекания биосинтеза: например, при отсутствии фактора EF-G трансляции не происходит, при добавлении антибиотика фусидовой кислоты блокируется диссоциация EF-G от рибосомы, а антибиотик эритромицин останавливает синтез на стадии 7 аминокислот.

Рисунок 2. Последовательность флуоресцентных вспышек, кодирующая информацию о ходе транскрипции. Готовность «стартового» состояния рибосомы определяется по флуоресценции меченной тРНК fMet–(Cy3)–тРНК fMet , связанной со старт-кодоном. Прибытие Phe–(Cy5)–тРНК Phe или Lys–(Cy2)–тРНК Lys отмечается красной или голубой вспышкой, соответственно. При низкой концентрации тРНК (сверху ) связывание с рибосомой происходит достаточно редко (существенно реже одного раза в секунду), и флуорофор иногда успевает «отбелиться» под влиянием лазерного излучения, индуцирующего флуоресценцию. При высоких (близких к физиологическим) концентрациях тРНК (снизу ) связывание происходит чаще одного раза в секунду, и фотоотбеливания не происходит (вспышки накладываются). Это соответствует состоянию с двумя молекулами тРНК, связанными с рибосомой (схематически показано под осью времени).

Наблюдение за трансляцией на уровне отдельных молекул в реальном времени открывает новые горизонты в изучении биосинтеза белкá, механизмов его регуляции и конформационных переходов в рибосоме. Остроумная флуоресцентная технология, разработанная изначально для секвенирования одиночных молекул ДНК в пóрах. Nature . 452 , 598-603;

Рибосомы являются важнейшими органоидами клетки, так как на них протекает процесс трансляции - синтез полипептида на матричной РНК (мРНК). Другими словами, рибосомы служат местом белкового синтеза .

Строение рибосом

Рибосомы относятся к немембранным органоидам. Они очень мелкие (около 20 нм), но многочисленные (тысячи и даже миллионы на клетку), состоят из двух частей – суб ъединиц . В состав субчастиц входят рибосомальные РНК (рРНК) и рибосомные белки, т. е. рибосомы по химическому составу являются рибонуклеопротеи д ами . Однако в них также присутствует небольшое количество низкомолекулярных соединений. Из-за многочисленности рибосом, рРНК составляет более половины от всей РНК клетки.

Одну из субъединиц называют «малой», вторую – «большой».

В собранной из субъединиц рибосоме выделят два (по одним источникам) или три (по другим) участка, которые называют сайтами . Один из участков обозначают A (aminoacyl) и называют аминоацильным, второй - P (peptidyl) - пептидильный. Данные сайты являются основными каталитическими центрами протекающих на рибосомах реакций. Третий участок обозначают E (exit), через него освободившаяся от синтезируемого полипептида транспортная РНК (тРНК), покидает рибосому.

Кроме перечисленных сайтов на рибосомах есть другие участки, используемые для связывания различных ферментов.

Когда субъединицы диссоциированы (разъединены) специфичность сайтов теряется, т. е. они определяются сочетанием соответствующих областей обеих субъединиц.

Отличие рибосом прокариот и эукариот

Соотношение по массе белков и РНК в рибосоме примерно поровну. Однако у прокариот белков меньше (около 40%).

Размеры как самих рибосом, так и субъединиц выражают в скорости их седиментации (осаждения) при центрифугировании. При этом S обозначает константу Сведберга - единицу, характеризующую скорость оседания в центрифуге (чем больше S, тем быстрее частица осаждается, а значит тяжелее). У прокариот рибосомы имеют размер в 70S, а у эукариот - в 80S (т. е. они тяжелее и крупнее). При этом субъединицы прокариотических рибосом имеют значения 30S и 50S, а эукариотических - 40S и 60S. Размеры рибосом в митохондриях и хлоропластах эукариот сходны с прокариотическими (хотя имеют определенную вариабельность по размерам), что может указывать на их происхождение от древних прокариотических организмов.

У прокариот в состав большой субъединицы рибосом входит две молекулы рРНК и более 30 молекул белка, в состав малой - одна молекула рРНК и около 20 белков. У эукариот в субъединицах больше молекул белка, а также в большой субъединице три молекулы рРНК. Составляющие рибосому белки и молекулы рРНК обладают способностью к самосборке и в итоге образуют сложную трехмерную структуру. Структуру рРНК поддерживают ионы магния.

Синтез рРНК

У эукариот в состав рибосом входят 4 вида рРНК. При этом три образуются из одного транскрипта-предшественника - 45S рРНК. Он синтезируется в ядрышке (на петлях хромосом его формирующем) при помощи РНК-полимеразы-1. Гены рРНК имеют много копий (десятки и сотни) и обычно располагаются на концах разных пар хромосом. После синтеза 45S рРНК разрезается на 18S, 5.8S и 28S рРНК, каждая из которых подвергается тем или иным модификациям.

Четвертый вид рРНК синтезируется вне ядрышка с помощью фермента РНК-полимеразы-3. Это 5S РНК, которая после синтеза не нуждается в .

Третичная структура рРНК в составе рибосом очень сложная и компактная. Она служит каркасом для размещения рибосомных белков, которые выполняют вспомогательные функции для поддержания структуры и функциональности.

Функция рибосом

Функционально рибосомы являются местом связывания молекул, участвующих в синтезе (мРНК, тРНК, различные факторы). Именно в рибосоме молекулы могут занять друг по отношению к другу такое положение, которое позволит быстро протечь химической реакции реакции.

В эукариотических клетках рибосомы могут находиться свободно в цитоплазме или быть прикрепленными с помощью специальных белков к ЭПС (эндоплазматическая сеть, она же ЭР - эндоплазматический ретикулум).

В процессе трансляции рибосома перемещается по мРНК. Часто по одной нитевидной мРНК двигаются несколько (или множество) рибосом, образуя так называемую полисому (полирибосому).

История изучения строения рибосом насчитывает более полувека со времени их открытия, и краткое описание методов, использованных для этого, представляет отдельный интерес, поскольку эти методы используются или могут быть использованы для изучения не только рибосом, но и других сложных надмолекулярных комплексов.

Итак, к 1940 г. Альберт Клод (США) сумел выделить из эукариотических клеток цитоплазматические РНК-содержащие гранулы, гораздо меньшие, чем митохондрии и лизосомы (от 50 до 200 мкм в диаметре); позже он назвал их микросомами. Результаты химических анализов показали, что микросомы Клода были рибонуклеопротеидными комплексами. В дополнение к этому, цитохимические работы Т. Касперсона (Швеция) и Ж.Браше (Бельгия) продемонстрировали, что чем интенсивнее идет белковый синтез, тем больше обнаруживается РНК в цитоплазме.

В дальнейшем, некоторым исследователям удавалось выделять из клеток бактерий, животных и растений частицы, ещё более мелкие, чем микросомы. Электронная микроскопия и седиментационный анализ в ультрацентрифуге указывали, что частицы компактны, более или менее сферичны и гомогенны по размеру, имея диаметр 100-200 Ȧ (ангстрем) и обнаруживая резкие седиментационные границы с коэффициентами седиментации от 30-40S до 80-90S (S-коэффициент седиментации , или константа Сведберга, - отражает скорость осаждения каких-либо молекулярных комплексов при скоростном ультрацентрифугировании и зависит от молекулярного веса частиц и их плотности – компактности ). Пожалуй, первое ясное свидетельство, что такие частицы бактерий являются рибонуклеопротеидами было получено Г.К. Шахманом, А.Б. Парди и Р. Станиером (США) в 1952 г.

Улучшенная техника микротомии и электронной микроскопии ультратонких срезов животных клеток привела к выявлению однородных плотных гранул с диаметром около 150 Ȧ непосредственно в клетке. Электронно-микроскопические исследования Дж. Паладе (США) , проведенные в 1953-1955 гг., показали, что маленькие плотные гранулы в изобилии содержатся в цитоплазме животных клеток. Они видны либо присоединенными к мембране эндоплазматического ретикулума, либо свободно рассеяны в цитоплазме. Микросомы Клода оказались фрагментами эндоплазматического ретикулума с сидящими на них гранулами. Выяснилось, что эти «гранулы Паладе» являются рибонуклеопротеидными частицами и что они представляют основную массу цитоплазматической РНК, обеспечивающей белковый синтез.

Исследования функциональной роли рибосом шли параллельно с их обнаружением и структурным описанием. Первой убедительной демонстрацией того, что именно рибонуклеопротеидные частицы микросом ответственны за включение аминокислот в новосинтезированный белок, были эксперименты П. Замечника с сотрудниками (США), опубликованные в 1955 г. За этим последовали эксперименты из этой же лаборатории, показавшие, что свободные рибосомы не прикрепленные к мембранам эндоплазматического ретикулума, также включают аминокислоты и синтезируют белок, освобождающийся затем в растворимую фазу. Функции бактериальных рибосом были предметом интенсивных исследований группы Р.Б. Робертса (США); публикация К. МакКиллена, Р.Б. Робертса и Р.Дж. Бриттена в 1959 г. окончательно установила, что белки синтезируются в рибосомах и затем распределяются по другим частям бактериальной клетки.

Введение
Глава 1. Строение рибосом
Глава 2. История открытия рибосом
Глава 3. История развития методов изучения рибосом
3.1. Электронная микроскопия
3.2. Рентгеноструктурный анализ (РСА)
3.3. Футпринтинг (химическое зондирование)
3.4. Аффинная модификация
3.5. Другие методы исследования рибосом
Заключение
Список использованных источников

Введение

Более шестидесяти лет тому назад, в 1953 г., Д. Уотсон и Ф. Крик открыли принцип строения дезоксирибонуклеиновой кислоты . Структура ДНК пролила свет на механизм точного воспроизведения – удвоения генетического материала . Произошло становление новой науки – молекулярной биологии. Была сформулирована так называемая центральная догма молекулярной биологии: ДНК → РНК → белок, смысл которой состоит в том, что генетическая информация, записанная в ДНК, реализуется в виде белков, но не непосредственно, а через участие родственного биополимера – рибонуклеиновую кислоту (РНК), и этот путь от нуклеиновых кислот к белкам необратим. Таким образом, ДНК копируется по матрице ДНК, обеспечивая собственную репликацию, то есть воспроизведение исходного генетического материала в поколениях; РНК синтезируется по матрице ДНК, в результате чего происходит переписывание, или транскрипция, генетической информации в форму различных копий РНК; молекулы иРНК служат матрицами для синтеза белков – генетическая информация транслируется в форму полипептидных цепей.

Итак, важнейшим процессом жизнедеятельности всех организмов – от примитивных бактерий до человека, – является реализация генетической информации, закодированной в их ДНК. Завершающим этапом этого процесса является трансляция (биосинтез белков на рибосомах) – перевод последовательности нуклеотидов информационной (матричной) РНК-комплементарной копии ДНК, в последовательности аминокислотных остатков синтезируемых белков. Белки – биополимеры, ответственные практически за все биохимические реакции, происходящие в клетках живых организмов, – определяют большинство признаков организма, осуществляют регуляцию и координацию его жизнедеятельности. Трансляция осуществляется сложными клеточными надмолекулярными машинами – рибосомами . Именно они ответственны за сложный, многоэтапный процесс биосинтеза всех без исключения клеточных белков.

Изучение процесса трансляции началось в конце 50-х годов XX века и было неразрывно связано с изучением структуры рибосомы. Термин «рибосома» был введен в 1958 г. для описания рибонуклеопротеиновых частиц размером 10-20 нм, которые изначально были выделены в начале 40-х годов из надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования гомогената, образованного при разрушении нормальных и опухолевых клеток эукариот. В начале 50-х годов было обнаружено, что именно на этих частицах осуществляется синтез белка у эукариот, тогда как для бактериальных клеток аналогичные данные удалось получить лишь в конце 50-х годов. С тех пор накоплено огромное количество информации о структуре рибосом – уникальных рибонуклеопротеинов, обладающих очень сложной структурой и состоящих из большой и малой субчастиц, каждая из которых содержит рибосомные РНК (рРНК) и несколько десятков белков. К концу ХХ века были установлены последовательности аминокислотных остатков всех рибосомных белков и последовательности нуклеотидов рРНК многих организмов от кишечной палочки до человека. Наиболее впечатляющие успехи в расшифровке структуры рибосом были достигнуты на рубеже XX и XXI столетий благодаря рентгеноструктурному анализу (РСА), который позволил установить строение рибосом бактерий с разрешением, позволяющим «видеть» отдельные нуклеотиды рРНК и аминокислотные остатки белков. До настоящего времени (2014 г.) рибосома является наиболее сложной клеточной структурой, строение которой расшифровано на уровне отдельных атомов. В 2009 г. трое ученых (В. Рамакришнан из Англии, Т. Стейц из США и А. Йонат из Израиля) получили Нобелевскую премию по химии за установление атомарной структуры бактериальных рибосом.

Глава 1. Строение рибосом

Чтобы читателю было легче воспринимать дальнейший материал, считаю необходимым привести краткую характеристику объекта, об истории открытия и изучения которого в дальнейшем пойдет речь. Итак, рибосомы – это клеточные органоиды (есть и у прокариот – одноклеточных организмов, у которых нет оформленного ядра, к которым относятся бактерии и археи, и у эукариот – настоящих ядерных – организмов, у которых в клетке есть ядро, к ним относятся как одноклеточные, так и многоклеточные представители царств грибов, растений и животных; эукариоты устроены гораздо сложнее, что влечёт за собой усложнение организации их клеточных структур, в связи с чем весьма затруднено их изучение), ответственные за биосинтез белка. Каждая рибосома состоит из двух субчастиц – большой и малой, которые в свою очередь, состоят из рибосомных РНК (рРНК) и нескольких десятков рибосомных белков. Агрегаты РНК и белков принято называть рибонуклеопротеинами.

РНК в составе рибосом служит каркасом, к которому «нужным» образом присоединяются рибосомные белки, формируя две рибосомные субчастицы – большую и малую, которые собираясь вместе, образуют зрелую функционально активную рибосому. Работают эти органоиды в цитоплазме; у эукариот они могут находиться в свободном состоянии, либо могут быть инкорпорированы в состав эндоплазматического ретикулума-гранулярный ЭПС (у прокариот мембранных органоидов нет, поэтому все их рибосомы находятся в свободном состоянии в цитоплазме). Рибосомы осуществляют перевод последовательности нуклеотидов информационной РНК (иРНК) в последовательность аминокислот белка согласно правилам генетического кода. Аминокислоты для синтеза доставляются к рибосоме с помощью транспортных РНК (тРНК).

Глава 2. История открытия рибосом

История изучения строения рибосом насчитывает более полувека со времени их открытия, и краткое описание методов, использованных для этого, представляет отдельный интерес, поскольку эти методы используются или могут быть использованы для изучения не только рибосом, но и других сложных надмолекулярных комплексов.

Итак, к 1940 г. Альберт Клод (США) сумел выделить из эукариотических клеток цитоплазматические РНК-содержащие гранулы, гораздо меньшие, чем митохондрии и лизосомы (от 50 до 200 мкм в диаметре); позже он назвал их микросомами. Результаты химических анализов показали, что микросомы Клода были рибонуклеопротеидными комплексами. В дополнение к этому, цитохимические работы Т. Касперсона (Швеция) и Ж.Браше (Бельгия) продемонстрировали, что чем интенсивнее идет белковый синтез, тем больше обнаруживается РНК в цитоплазме.

В дальнейшем, некоторым исследователям удавалось выделять из клеток бактерий, животных и растений частицы, ещё более мелкие, чем микросомы. Электронная микроскопия и седиментационный анализ в ультрацентрифуге указывали, что частицы компактны, более или менее сферичны и гомогенны по размеру, имея диаметр 100-200 Ȧ (ангстрем) и обнаруживая резкие седиментационные границы с коэффициентами седиментации от 30-40S до 80-90S (S -коэффициент седиментации , или константа Сведберга, – отражает скорость осаждения каких-либо молекулярных комплексов при скоростном ультрацентрифугировании и зависит от молекулярного веса частиц и их плотности – компактности). Пожалуй, первое ясное свидетельство, что такие частицы бактерий являются рибонуклеопротеидами было получено Г.К. Шахманом, А.Б. Парди и Р. Станиером (США) в 1952 г.

Улучшенная техника микротомии и электронной микроскопии ультратонких срезов животных клеток привела к выявлению однородных плотных гранул с диаметром около 150 Ȧ непосредственно в клетке. Электронно-микроскопические исследования Дж. Паладе (США) , проведенные в 1953-1955 гг., показали, что маленькие плотные гранулы в изобилии содержатся в цитоплазме животных клеток. Они видны либо присоединенными к мембране эндоплазматического ретикулума, либо свободно рассеяны в цитоплазме. Микросомы Клода оказались фрагментами эндоплазматического ретикулума с сидящими на них гранулами. Выяснилось, что эти «гранулы Паладе» являются рибонуклеопротеидными частицами и что они представляют основную массу цитоплазматической РНК, обеспечивающей белковый синтез.

Исследования функциональной роли рибосом шли параллельно с их обнаружением и структурным описанием. Первой убедительной демонстрацией того, что именно рибонуклеопротеидные частицы микросом ответственны за включение аминокислот в новосинтезированный белок, были эксперименты П. Замечника с сотрудниками (США), опубликованные в 1955 г. За этим последовали эксперименты из этой же лаборатории, показавшие, что свободные рибосомы не прикрепленные к мембранам эндоплазматического ретикулума, также включают аминокислоты и синтезируют белок, освобождающийся затем в растворимую фазу. Функции бактериальных рибосом были предметом интенсивных исследований группы Р.Б. Робертса (США); публикация К. МакКиллена, Р.Б. Робертса и Р.Дж. Бриттена в 1959 г. окончательно установила, что белки синтезируются в рибосомах и затем распределяются по другим частям бактериальной клетки.

Глава 3. История развития методов изучения рибосом

3.1. Электронная микроскопия

В связи с тем, что размеры рибосом в десятки раз меньше, чем длина волны видимого света, ее невозможно увидеть даже в самый совершенный оптический микроскоп, однако можно «посмотреть» с помощью электронного микроскопа, который направляет пучок электронов вместо света. Уже в 70-х годах ХХ века с помощью электронной микроскопии (ЭМ) были получены изображения рибосом и их субчастиц, позволяющие предположить их форму.

Электромикрофотография субчастиц рибсосом (слева) и одна из первых моделей малой 30 S субчастицы бактерий (справа), 1974 г.

Одни из первых «фотографий» рибосом были получены в пущинском Институте белка под руководством академика А.С. Спирина. В то же время в группах Г. Штоффлера, И. Шталя (Германия) и Дж. Лэйка (США) для детекции положений рибосомных белков на поверхности рибосомных субъединиц стали использовать иммуно-ЭМ , для чего рибосомные субчастицы обрабатывали антителами против какого-либо белка и смотрели, в каком месте они присоединяются, связываясь с эпитопами (фрагментами молекулы, специфично узнаваемые соответствующими антителами) целевого белка. Однако, точность определения была невысокой, кроме того, у некоторых белков было несколько антигенных детерминант, удаленных друг от друга на поверхности субчастицы, а у некоторых белков не было ни одной.

Резкий скачок в информативности данного метода произошел в середине 90-х годов, когда в лаборатории Й. Франка (США) был разработан новый подход – крио-ЭМ , основанный на получении электронных микрофотографий рибосом при очень низкой температуре (в жидком азоте, T= -196°C). Чтобы получить крио-ЭМ фотографии, монослой рибосом наносят на тонкую углеродную решетку. В 2000 г. были разработаны программы, позволяющие сепарировать электронную плотность в крио-ЭМ на белковую и рРНК-овую составляющие и подгонять крио-ЭМ карты к атомным моделям рибосомных субчастиц прокариот (к этому времени уже удалось расшифровать структуру менее сложно устроенных прокариотических рибосом с помощью метода РСА, речь о котором пойдет далее, тогда как никаких моделей эукариотических рибосом ещё получить не удалось). Это позволило распознавать фрагменты консервативного «кора» РНК («кор» – сердцевина, та часть структуры, которая в процессе эволюции оставалась практически неизменной от самых примитивных бактерий до самых высоко организованных организмов, включая человека) и рибосомные белки, имеющие прокариотических гомологов. За 10-14 лет, прошедших с момента изобретения метода, с помощью крио-ЭМ научились получать изображения рибосом с разрешением 7-8 Ȧ (это позволяет видеть, например, отдельные витки α-спиралей белков), что всего в 2-3 раза меньше разрешения, которое обычно дает рентгеноструктурный анализ. Резкое увеличение разрешающей способности в случае крио-ЭМ связано, в частности, с тем, что при очень низкой температуре «замораживаются» тепловые движения структурных элементов рибосомы, которые сильно размывают изображение, полученное с помощью «обычной» ЭМ. В прошлом, 2013 году в лаборатории Бэкманна были получены крио-ЭМ модели рибосом человека с довольно высоким разрешением 5.4 Ȧ .

Крио-ЭМ модели субчастиц человеческих рибосом, 2013 г. Подписаны рибосомные белки и некоторые морфологические элементы субчастиц.

Преимуществом крио-ЭМ по сравнению с РСА (рентгеноструктурный анализ) является то, что этот метод не требует выращивания кристаллов – процедуры длительной и не всегда дающей результат. Кроме того, для крио-ЭМ требуется намного меньше материала, чем для РСА. К недостаткам крио-ЭМ следует отнести то, что разрешение, которое может дать этот метод, пока не позволяет четко “видеть” неструктурированные нитевидные фрагменты рибосомных белков и рРНК, триплеты иРНК и некоторые другие важные детали.

3.2. Рентгеноструктурный анализ (РСА)

Методы рентгеноструктурного анализа позволяют судить о строении биологических макромолекул и их комплексов (в частности, эти методы помогли установить в 1953 году структуру ДНК). В основе рентгеноструктурного анализа лежит получение кристаллов макромолекул и просвечивание их рентгеновскими лучами. По характеру дифракции рентгеновских лучей, проходящих через эти кристаллы, можно судить о строении образующих кристаллы молекул. Если кристаллы хорошего качества, то такую картину можно расшифровать с помощью специальных компьютерных программ, и это в принципе позволяет определить координаты всех атомов, из которых они построены. Поэтому РСА считают одним из наиболее мощных и информативных методов для изучения строения рибосом и других сложных белково-нуклеиновых комплексов.

К недостаткам метода можно отнести, в первую очередь, трудности кристаллизации – до сих пор кристаллизация сложных рибонуклеопротеидов является скорее не наукой, а искусством, которым владеют лишь в нескольких лабораториях в мире. Даже к началу восьмидесятых годов XX века никому еще не удавалось получить пригодные для анализа кристаллы ни полных рибосом, ни их отдельных субъединиц. Вообще, кристаллизация каждого нового модельного комплекса рибосом с участниками процесса трансляции является событием.

Получить пригодные для РСА кристаллы рибосомных субчастиц даже простейших эукариот удалось впервые лишь в 2010 г. (это было сделано в группе М. Юсупова в Страсбурге). Определенные с помощью РСА координаты атомов рибосом и их модельных комплексов помещают в доступный через интернет банк данных, каждая структура имеет свой код, который известен из публикаций в научных журналах. Визуально структурную информацию можно представлять любым удобным образом. В качестве примера ниже приведена структура малой субчастицы рибосом термофильной бактерии Thermus thermophilus, полученная в 2002 г. в лаборатории В. Рамакришнана – одного из трех Нобелевских лауреатов по химии 2009 г., получивших премию за расшифровку структуры рибосомы. На этой структуре полипептидные цепи белков и полинуклеотидные цепи рРНК изображены ленточками.

Строение малой субчастицы рибосом Thermus thermophilus по данным РСА, 2002 г.

При всей ценности результатов, полученных с помощью РСА, следует отдавать себе отчет, что кристаллы рибосом получают в условиях, очень далеких от физиологических: при высокой концентрации солей и в присутствии специальных органических добавок (например, метилпентандиола) при пониженной температуре. Поэтому строение реально работающей рибосомы может заметно отличаться от строения рибосомы в кристалле. Наконец, РСА дает информацию только об одном, «замороженном», состоянии рибосомы, и не дает представления о конформационной динамике, необходимой для функционирования рибосомы. Поэтому полноценное представление о той структуре нуклеопротеида, которая осуществляет свои функции в клетке, можно получить только из совокупности данных, полученных с помощью РСА и различных биохимических подходов, о которых пойдет речь ниже.

3.3. Футпринтинг (химическое зондирование)

Футпринтинг объединяет группу методов, предназначенных для определения участков рРНК, вовлеченных в связывание с рибосомой участников процесса трансляции (чаще всего тРНК или факторов трансляции), называемых для краткости лигандами рибосомы. Суть метода состоит в определении нуклеотидов рРНК, защищаемых лигандами от химической модификации или гидролиза, вызванного действием ферментов или гидроксил-радикалов (название метода связано с тем, что лиганд, защищая определенные участки рРНК, как бы оставляет свой “отпечаток” на рибосоме). Гидроксил-радикальный пробинг РНК в составе нуклеопротеидов стал развиваться относительно недавно; гидроксил-радикалы, способные расщеплять фосфодиэфирные связи РНК, обычно генерируют, используя перекись водорода и катализаторы ее диссоциации, например, ионы Fe 2+ в сочетании с аскорбиновой кислотой. Положение модифицированных реагентами нуклеотидов или разрывов в рРНК определяют с помощью обратной транскрипции – синтеза комплементарной цепочки ДНК по РНК как по матрице с использованием меченого праймера – короткого фрагмента ДНК, комплементарного 3’-концевой части изучаемой области РНК. Синтез растущей цепи обрывается, когда обратная транскриптаза (фермент, который осуществляет синтез молекул ДНК по матрице РНК, впервые охарактеризован в 1970 г Балтимором и Тёминым; данный фермент имеется у вирусов, геном которых представлен молекулами РНК – эти вирусы называют «ретровирусы», например ВИЧ) доходит до модифицированного основания в РНК, которое не может образовывать «нормальную» комплементарную пару, или до места разрыва в РНК. Синтезированные фрагменты комплементарной ДНК определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле точно так же, как это делают при секвенировании по методу Сэнгера (с использованием дидезоксинуклеозид-трифосфатов, или «стопперов», в параллельных экспериментах).

Следует иметь в виду, что данные футпринтинга в определенной степени неоднозначны, поскольку защита любого нуклеотида рРНК от химической модификации или гидролиза может быть связана не только с тем, что он экранирован лигандом, но и с вторичными эффектами – например, структурными перестройками в рРНК, вызванными связыванием лиганда в отдаленном от этого нуклеотида участке рибосомы. Наиболее информативным оказывается применение и химического, и энзиматического пробинга одновременно. Эти методы дают взаимно дополняющую информацию, поскольку, как правило, участки, где меняется доступность нуклеотидов для химической модификации, не совпадают с участками, где меняется доступность фосфодиэфирных связей для гидролиза ферментами.

Первые значительные результаты по изучению структуры и функции рибосом с помощью химического футпринтинга были получены в группе американского рибосомолога Г. Ноллера в 80-х годах ХХ века. Сравнивая наборы нуклеотидов рРНК в рибосомах E. coli, защищаемых от модификации молекулами тРНК в составе различных модельных комплексов, удалось определить, какие участки рРНК вовлечены в формирование А, Р и Е-участков, пептидилтрансферазного центра и выдвинуть ряд принципиальных предположений о том, что тРНК при движении в процессе цикла элонгации из А-участка в Р, а из Р-участка в Е проходит через промежуточные – так называемые «гибридные» состояния. Так, перед транслокацией пептидил-тРНК из А-участка в Р после связывания фактора EF-G и GTP молекула пептидил-тРНК переходит в гибридное состояние A/P (3’-конец с растущим пептидом уже в Р-участке, а антикодон все еще связан с кодоном мРНК в А-участке), а молекула деацилированной тРНК в Р-участке – в гибридное состояние P/E (3’-конце уже в Е-участке, а антикодон все еще связан с кодоном мРНК в Р-участке). В настоящее время существование гибридных состояний тРНК подтверждено различными методами, в том числе и для рибосом эукариот. В «пост-рентгеновскую эпоху» (ХХI век) футпринтинг использовали и используют в основном для изучения рибосом эукариот, для которых метод РСА пока не даёт достаточного разрешения, чтобы различить элементы тонкой структуры.

Методологию футпринтинга можно использовать также для выявления экспонированных (не экранированных белками) в составе рибонуклеопротеида фрагментов РНК . В этом случае сравнивают доступность нуклеотидов свободной рРНК и рРНК в составе рибосомы. Наконец, для определения положения мРНК на рибосоме используют метод тоу-принтинга . В основе метода – обратная транскрипция на мРНК (в составе комплекса с рибосомой), как на матрице с использованием праймера, комплементарного 3’-концевому фрагменту мРНК, находящемуся вне рибосомы. Обратная транскриптаза ведет синтез кДНК до тех пор, пока «не натолкнется» на рибосому. Определив длину синтезированной кДНК, можно судить о том, какая часть мРНК с 3’-стороны находится вне рибосомы, и тем самым, положение мРНК на рибосоме. Метод очень удобен для того, чтобы следить за процессом транслокации мРНК – передвижение мРНК на каждый триплет в 5’-сторону приводит к укорочению на три нуклеотида 3’-концевой части мРНК, находящейся вне рибосомы.

3.4. Аффинная модификация

Аффинная модификация, или аффинное химическое сшивание, основано на использовании химически активных производных лигандов рибосомы – участников процесса трансляции (тРНК, мРНК и пр.), несущих сшивающие группы в определенных положениях. Такие производные сшивают с рибосомами в составе комплексов, моделирующих ту или иную стадию трансляции, и затем определяют, к каким рибосомным белкам и/или нуклеотидам рРНК они ковалентно присоединились. В результате получают информацию о том, с какими структурными элементами рибосомы соседствует фрагмент лиганда, несущий сшивающую группу. Аффинный реагент обычно несет также метку (чаще всего радиоактивную), позволяющую следить за компонентами рибосомы, к которым он присоединился. Как правило, для изучения функциональных центров рибосом использовали аффинные реагенты на основе тРНК или фрагментов мРНК, поскольку получение аффинных реагентов на основе факторов трансляции – намного более сложная задача. Общая схема эксперимента по аффинной модификации рибосом (в качестве примера приведен реакционноспособный аналог мРНК) выглядит следующим образом:

В становлении и развитии метода аффинной модификации для изучения не только рибосом, но и активных центров ферментов и различных комплексов нуклеиновых кислот огромную роль сыграл Новосибирский институт биоорганической химии АН СССР (с 2003 г. – Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН), основанный академиком Д.Г. Кнорре. Один из отделов этого института – лаборатория Г.Г. Карповой, уже много лет является одним из мировых лидеров по изучению структуры и функции рибосом.

3.5. Другие методы исследования рибосом

Методы, рассмотренные выше сыграли наиболее значительную роль в установлении структуры рибосомы и строения ее функциональных центров и уже имеют свою историю, однако, ими, конечно, не исчерпывается набор методов, использованных для изучения рибосом. Из методов, которые подробно не были рассмотрены, стоит упомянуть малоугловое рассеяние нейтронов или рентгеновских лучей, позволяющее получать информацию о компактности частицы и радиусе инерции (радиусе вращения), что позволяет судить, в частности, о том, в каком виде частица находится в растворе – в мономерном или олигомерном. Метод ЯМР на ядрах 15 N и 13 C позволяет, в частности, изучать в растворе динамические свойства рибосомных компонентов или лигандов, связанных с рибосомой. Для изучения прокариотической рибосомы и ее субчастиц используют также группу методов, в основе которых лежит их способность к самосборке in vitro из суммы белков и рРНК. В выбранных участках рибосомного белка или рРНК можно делать замены (или делеции) аминокислотных остатков или нуклеотидов, затем собирать рибосому с участием такой «мутантной» формы белка или рРНК и смотреть, сохраняется ли способность к сборке. Если не сохраняется – значит, данный участок задействован в сборке. Если сборка происходит, то можно выяснить, оказывает ли влияние на какую-либо функцию рибосомы (способность связывать аа-тРНК, факторы трансляции, синтезировать пептидную связь, проводить транслокацию и пр.) сделанная замена или делеция, и таким образом получить информацию об участке белка или рРНК, вовлеченным в выполнение рибосомой данной функции. Эти методы неприменимы к рибосомам эукариот, неспособным к самосборке in vitro.

Заключение

В последние годы произошел прорыв в структурных исследованиях рибосом и рибосомных субчастиц. В ходе исследований строения рибосом были усовершенствованы методы рентгеноструктурного анализа, что позволило описывать с атомарным разрешением взаимодействие рибосомы с белками, управляющими ее работой, и с молекулами тРНК, а также изменения, происходящие в структуре рибосомы в процессе синтеза белка.

Это позволяет по новому взглянуть на процесс биосинтеза белка и соотнести накопленные к настоящему времени биохимические данные со структурными. Особый интерес полученные результаты имеют для исследования РНК-белковых взаимодействий, которые до сих пор изучены достаточно слабо. Модели рибосомы дают весомую базу для анализа РНК-белковых взаимодействий, классификации типов укладок РНК и типов РНК-белковых контактов.

На сегодняшний день рибосомы - самые большие несимметричные макромолекулярные комплексы с установленной структурой (строение вирусов изучать легче в связи с их симметричностью). Можно ожидать, что в дальнейшем рентгеноструктурный анализ будет успешно применен и для исследования строения и работы других крупных макромолекулярных комплексов, например сплайсосом, вырезающих из предшественников информационной РНК некодирующие последовательности (интроны).

Около двух третей массы рибосомы составляет РНК, а около трети - белки. Исследования строения и работы рибосом показали, что функциональную нагрузку в рибосомах несет, прежде всего, РНК. Таким образом, рибосомы - это, по сути, гигантские рибозимы (каталитически активные РНК; ранее считалось, что роль катализаторов могут выполнять только белки). Это открытие говорит в пользу гипотезы, согласно которой на первых этапах существования жизни она представляла собой «мир РНК»: молекулы РНК обеспечивали и хранение наследственной информации, и управление химическими процессами, необходимыми для считывания и воспроизведения этой информации; впоследствии эти функции в ходе эволюции были переданы соответственно ДНК и белкам.

Представления о структуре рибосом находят и непосредственное практическое применение. Многие антибиотики, используемые для лечения инфекционных заболеваний, действуют за счет подавления работы бактериальных рибосом. В лабораториях Йонат, Рамакришнана и Стейца были получены данные о механизме действия ряда таких антибиотиков. Эти данные уже сегодня используются для разработки новых и совершенствования существующих антибиотиков. Задача эта весьма актуальна, поскольку болезнетворные бактерии непрерывно эволюционируют, вырабатывая устойчивость к используемым в медицинской практике средствам, и фармацевтике нельзя отставать от бактерий в этой непрерывной «гонке вооружений».

Список использованных источников

1. Watson J.D., Crick F.H.C. Molecular structure of nucleic acids // Nature. 1953. V. 171. P. 738-740.
2. Watson J.D., Crick F.H.C. Genetic implications of the structure of deoxyribose nucleic acid // Nature 1953 V. 171. P. 964-967.
3. G.E. Palade. (1955) «A small particulate component of the cytoplasm.» J Biophys Biochem Cytol. Jan;1(1): pages 59-68.
4. Roberts, R. B. (1958) «Introduction» in Microsomal Particles and Protein Synthesis. New York: Pergamon Press.
5. Nature 2013.Andreas Anger et al. Structure of the human and Drosophila 80S ribosome.
6. Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка, 1986.
7. Грайфер Д.М., Моор Н.А. Биосинтез белка: учебное пособие. /Новосиб.гос.ун-т. Новосибирск, 2011.

Реферат на тему “История развития представлений о структуре и функциях рибосом” обновлено: Декабрь 31, 2017 автором: Научные Статьи.Ру