], однако определение антиоксидантов как химических соединений не дает полного представления о защитных свойствах изучаемого объекта: они обусловливаются не только количеством того или иного антиоксиданта, но также активностью каждого из них. Активность антиоксиданта, или антиоксидантная активность, АОА, - это константа скорости реакции антиоксиданта со свободным радикалом (kInH). Метод хемилюминесценции (ХЛ) позволяет определять общее количество радикалов, которое связывают антиоксиданты в образце (общую антиоксидантную емкость, ОАЕ), а при использовании метода математического моделирования кинетики ХЛ - также скорость образования и реакции радикалов с антиоксидантами, то есть АОА [ , , ].

Наиболее распространенная модификация хемилюминесцентного метода определения общей антиоксидантной емкости основана на применении люминола в качестве активатора хемилюминесценции [ , , , ]. В кювету хемилюминометра помещают образец с добавлением люминола, пероксида водорода и соединения, способного образовывать радикалы в результате спонтанного распада (термолиза), например 2,2’-азобис-(2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП): АБАП → 2R . В присутствии молекулярного кислорода алкильный радикал R образует пероксильный радикал ROO : R + O 2 → ROO . Далее пероксильный радикал окисляет хемилюминесцентный зонд люминол (LH 2), и образуется радикал люминола (LH ): ROO + LH 2 → ROOH + LH . Из LH через образование промежуточных веществ (гидропероксида люминола и эндопероксида люминола) образуется молекула конечного продукта окисления люминола, аминофталевой кислоты, в электронно-возбужденном состоянии, которая высвечивает фотон, и в результате наблюдается хемилюминесценция . Интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образования фотонов, а она, в свою очередь, пропорциональна стационарной концентрации LH в системе. Взаимодействуя с радикалами, антиоксиданты прерывают описанную цепочку превращений и препятствуют образованию фотона.

Соединения, подверженные термолизу, - не единственный возможный источник радикалов при анализе антиоксидантной емкости образца хемилюминесцентным методом. Альтернативами являются системы пероксидаза хрена–перекись водорода [ , ], гемин–пероксид водорода , цитохром с –кардиолипин–пероксид водорода и др. Схема реакций окисления люминола пероксидазами рассмотрена в работе Cormier и соавт. .

Кинетические кривые ХЛ для этих систем отражают две стадии реакции: стадию увеличения интенсивности ХЛ и стадию плато или постепенного спада свечения, когда интенсивность ХЛ либо постоянна, либо медленно снижается. В работе описаны два подхода к измерению общей антиоксидантной емкости, учитывающие эту особенность кривых. Метод TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) основан на измерении латентного периода ХЛ τ и может быть использован для определения таких антиоксидантов, как тролокс или аскорбиновая кислота: они характеризуются высоким значением константы скорости реакции с радикалами и по этой причине могут быть названы сильными антиоксидантами . В течение латентного периода происходит их полное окисление. Методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) измеряют степень тушения хемилюминесценции q на плато или в максимуме хемилюминесцентной кривой: формула , где I - интенсивность хемилюминесценции без антиоксиданта, а I 1 - интенсивность ХЛ в присутствии антиоксиданта. Этот метод используется, если в системе присутствуют преимущественно слабые антиоксиданты с низкими константами скорости взаимодействия с радикалами - намного более низкими в сравнении с константой люминола .

Действие антиоксидантов характеризуют не только показателями τ и q . Как видно из работ [ , ], действие таких антиоксидантов, как мочевая кислота в системе гемин–H 2 O 2 –люминол или токоферол, рутин и кверцетин в системе цитохром с –кардиолипин–H 2 O 2 –люминол, характеризуется изменением максимальной скорости нарастания ХЛ (v max ). Как показывают результаты математического моделирования кинетики, значения констант скорости взаимодействия этих антиоксидантов с радикалами близки к значению константы люминола, поэтому такие антиоксиданты могут быть названы антиоксидантами средней силы .

Если бы изучаемый материал, в частности растительное сырье, содержал только один тип антиоксидантов, то их содержание можно было бы характеризовать одним из трех перечисленных выше показателей (τ , q или v max ). Но в растительном сырье содержится смесь антиоксидантов разной силы. Чтобы решить эту проблему, некоторые авторы [ , , , ] использовали изменение светосуммы хемилюминесценции за определенное время ∆S, рассчитанное по формуле , где ∆S 0 и ∆S S - светосуммы ХЛ за заданное время t в контрольном и исследуемом образцах соответственно. Время должно быть достаточным для окисления всех антиоксидантов в системе, то есть для выхода кривой ХЛ исследуемого образца на уровень кривой ХЛ контрольного образца. Последнее предполагает, что исследователи должны не только регистрировать светосумму свечения, но и записывать кривую кинетики ХЛ в течение достаточно длительного времени, что делают далеко не всегда.

Поскольку все измеряемые показатели зависят от прибора и условий измерения, антиоксидантный эффект вещества в исследуемой системе обычно сравнивают с эффектом антиоксиданта, принятого за стандарт, например тролокса [ , ].

Система пероксидаза хрена–пероксид водорода применялась для анализа общей антиоксидантной емкости растительного сырья многими авторами. В работах [ , ] для оценки количества антиоксидантов в образцах использовали латентный период ХЛ (метод TRAP), а в работах [ , , ] - площадь под кривой развития ХЛ. Однако в перечисленных работах не дано четкого обоснования выбора того или иного параметра для оценки ОАЕ.

Целью исследования было определить, как соотношение антиоксидантов различного типа влияет на ОАЕ, и модифицировать метод хемилюминесценции таким образом, чтобы иметь возможность точнее определять ОАЕ в растительном сырье. Для этого мы поставили перед собой несколько задач. Во-первых, сравнить кинетику ХЛ исследуемых объектов с кинетикой стандартных антиоксидантов трех типов (сильного, среднего и слабого), чтобы понять, антиоксиданты какого типа вносят основной вклад в ОАЕ исследуемых объектов. Во-вторых, рассчитать ОАЕ исследуемых объектов, измерив уменьшение светосуммы ХЛ под действием этих объектов в сравнении с действием антиоксиданта, обеспечивающего наибольший вклад в ОАЕ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования были промышленные образцы плодов боярышника, рябины и шиповника производства АО «Красногорсклексредства» (Россия), а также плоды малины, собранные авторами на территории Московской области в условиях естественного произрастания и высушенные при температуре 60–80 °С до прекращения выделения ими сока и деформации при надавливании.

Реактивами для анализа антиоксидантной емкости хемилюминесцентным методом служили: КH 2 PO 4 , 20 мМ буферный раствор (рН 7,4); пероксидаза из корней хрена (активность 112 ед./мг, М = 44 173,9), 1 мМ водный раствор; люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой кислоты, М = 177,11), 1 мМ водный раствор; пероксид водорода (Н 2 О 2 , М = 34,01), 1 мМ водный раствор; растворы антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, кверцетина, токоферола). Все реагенты - производства фирмы Sigma Aldrich (США).

Отвары плодов боярышника, рябины и шиповника и настой плодов малины готовили по методике Государственной фармакопеи СССР, изложенной в общей фармакопейной статье «Настои и отвары» .

Определение общей антиоксидантной емкости проводили путем регистрации хемилюминесценции на хемилюминометре Lum-100 («ДИСофт», Россия) с использованием программного обеспечения PowerGraph 3.3. Для определения ОАЕ в растительном сырье в кювету прибора помещали 40 мкл люминола в концентрации 1 мМ, 40 мкл пероксидазы хрена в концентрации 0,1 мкМ, от 10 до 50 мкл отвара или настоя (в зависимости от концентрации) и фосфатный буфер в количестве, необходимом для доведения общего объема пробы до 1 мл. Кювету устанавливали в прибор и регистрировали ХЛ, наблюдая фоновый сигнал. По истечении 48 с регистрации фонового сигнала в кювету вносили 100 мкл Н 2 О 2 в концентрации 1 мМ и продолжали регистрацию ХЛ в течение 10 мин. Готовили по четыре пробы с различной концентрацией каждого из растительных объектов. Регистрировали также ХЛ для растворов аскорбиновой кислоты, кверцетина и токоферола в пяти различных концентрациях для каждого из антиоксидантов. В дальнейшем ОАЕ образцов отваров и настоя пересчитывали на кверцетин.

Концентрации люминола, пероксидазы хрена и перекиси водорода были подобраны так, чтобы определять антиоксидантную емкость водных извлечений из лекарственного растительного сырья за приемлемое время (не более 10 мин). За это время кривые хемилюминесценции для антиоксидантов аскорбата и флавоноида кверцетина (основные антиоксиданты растительного сырья) выходили на плато, что указывало на полное разрушение антиоксидантов в системе. Разведения исследуемых образцов и концентрации растворов стандартных антиоксидантов (указаны в подписях к рисункам) подбирали таким образом, чтобы все кинетические кривые ХЛ были измерены при одной и той же чувствительности прибора.

Антиоксидантную емкость рассчитывали по изменению площади (∆S ) под кинетической кривой хемилюминесценции (светосуммы) при добавлении вещества, содержащего антиоксидант. Для этого подсчитывали S 0 для системы без антиоксиданта и вычитали из нее площадь S S , характеризующую систему, в которую был добавлен антиоксидант. Величина ∆S зависит от чувствительности хемилюминометра и условий измерения. Отношение ∆S/C · V (где C - концентрация исследуемого биологического материала в кювете, г/л, и V - объем кюветы, л) выражает антиоксидантную емкость 1 г изучаемого материала, т. е. растительного сырья.

Аналогичным образом рассчитывали антиоксидантную емкость ∆S A раствора стандартного антиоксиданта, например кверцетина, помещенного в тот же объем реакционной смеси. Отношение ∆S A /C A · V (где C A - весовая концентрация антиоксиданта в кювете, г/л) выражает антиоксидантную емкость 1 г антиоксиданта.

Для каждого из стандартных антиоксидантов регистрировали сигнал от растворов нескольких концентраций, чтобы убедиться в том, что расчеты ведутся в пределах линейной зависимости, а полученные результаты воспроизводимы. Действительно, была получена линейная зависимость (∆S A = k A · C A ) сигнала от концентрации, по которой рассчитали стехиометрический коэффициент k A . По критерию Фишера полученные для стандартных антиоксидантов значения k A статистически значимы с вероятностью 0,975. Далее регистрировали сигнал от четырех концентраций для каждого из четырех растительных образцов, и для всех образцов получили линейную зависимость сигнала от концентрации (∆S = k · C ), по которой рассчитали стехиометрический коэффициент k . С вероятностью 0,975 (критерий Фишера) полученные для растительных образцов значения k статистически значимы. Общую антиоксидантную емкость растительного материала в пересчете на массу стандартного антиоксиданта (мг%) находили по формуле .

Значения были представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратическое отклонение (M ± δ) при p

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение кинетики хемилюминесценции в присутствии аскорбата натрия (Рис. 1. Влияние аскорбата натрия на кинетику хемилюминесценции" data-note="Концентрации компонентов системы: люминол - 40 мкМ, пероксидаза хрена - 4 нМ, пероксид водорода - 100 мкМ. Кривые: 1 - контрольный образец; 2 - 0,05 мкМ; 3 - 0,10 мкМ; 4 - 0,15 мкМ; 5 - 0,2 мкМ; 6 - 0,25 мкМ аскорбата натрия.">рис. 1) показало, что для этого антиоксиданта характерен латентный период, когда ХЛ практически полностью подавлена. Его продолжительность пропорциональна количеству антиоксиданта в системе. При этом не изменяется ни наклон кривых ХЛ, ни интенсивность ХЛ на плато. Это объясняется тем, что аскорбиновая кислота - сильный антиоксидант, перехватывающий все радикалы, образующиеся в системе, в том числе радикалы люминола, и ХЛ не развивается до тех пор, пока не окислится весь аскорбат.

Другими исследователями также показано, что результаты химического анализа и значение ОАЕ, определенное хемилюминесцентным методом, часто не совпадают. В работе общая антиоксидантная емкость, определенная в системе пероксидаза–люминол–перекись водорода коррелировала с содержанием тритерпеновых соединений. Однако в работе тех же авторов , в которой объектом исследования было другое растение, не наблюдали корреляции ОАЕ с содержанием какой-либо группы веществ, в том числе флавоноидов.

Подобные расхождения связаны по меньшей мере с тремя факторами. Во-первых, имеет значение активность антиоксидантов, т. е. скорость их взаимодействия с радикалами, которая различна для разных антиоксидантов, входящих в состав растительного образца. По данным Измайлова , константы скорости соответствующих реакций для мексидола, токоферола и кверцетина соотносятся как 0,04: 2: 60. Во-вторых, каждая молекула антиоксиданта, вступая в химическую реакцию, может перехватить различное количество радикалов. По данным работы , кверцетин, мочевая и аскорбиновая кислоты перехватывали 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикалов на одну прореагировавшую молекулу антиоксиданта соответственно (использовалась система гемин–H 2 O 2 –люминол). В-третьих, на результаты исследования могло оказать влияние наличие пероксидазной активности у самих растительных образцов, как в работе , а также наличие в образцах кальция, который, как это показано в работе , способен в определенных условиях повышать активность пероксидазы хрена. Обычно это обусловливает более высокую интенсивность ХЛ на плато, чем на контрольных кривых, чего мы, однако, не наблюдали.

Первый фактор резко ограничивает применение такого параметра, как изменение светосуммы, так как время измерения хемилюминесценции должно быть больше времени расходования всех антиоксидантов в исследуемом образце. О наступлении этого момента можно судить, только измеряя кинетику хемилюминесценции. Кроме того, вклад слабых антиоксидантов в ОАЕ резко занижен, поскольку время их полного окисления во много раз превышает приемлемую продолжительность измерения (10–20 мин).

Еще большее значение имеет стехиометрический коэффициент антиоксиданта. Количество радикалов n , перехватываемое им, равно , где ρ - стехиометрический коэффициент, а ∆m - изменение концентрации антиоксиданта за время измерения, в нашем случае - исходная концентрация исследуемого вещества в опытной пробе.

Разница в светосумме свечения в отсутствие антиоксиданта и в его присутствии пропорциональна n . Суммарное число перехваченных радикалов равно , где ρ i - стехиометрический коэффициент конкретного антиоксиданта, а m i - его концентрация во время измерения. Суммарное число перехваченных радикалов заведомо не равно суммарному количеству антиоксидантов, поскольку коэффициенты ρ i не только не равны единице, но и существенно отличаются для разных антиоксидантов.

Величина n пропорциональна разнице светосумм, измеренных за определенное время между образцом, содержащим антиоксидант, и контрольным образцом, не содержащим антиоксидантов: S = k · n , где k - коэффициент, постоянный при одинаковых условиях измерения.

Рассмотренный в статье метод позволяет определить общую антиоксидантную емкость, тогда как химический анализ позволяет определить суммарное содержание антиоксидантов в продукте. Поэтому метод хемилюминесценции представляется информативнее химических анализов.

Подобранные нами условия оценки общей антиоксидантной емкости растительного сырья методом регистрации кинетики хемилюминесценции в системе, состоящей из пероксидазы хрена, перекиси водорода и люминола (концентрации компонентов - 4 нМ, 100 мкМ и 40 мкМ соответственно; 20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4), обеспечили окисление сильных антиоксидантов (аскорбиновая кислота) и антиоксидантов средней силы (кверцетин) за 10 мин. Такая продолжительность измерения удобна и обеспечивает требуемое качество измерений.

Анализ кинетики хемилюминесценции показал, что в изученных объектах (отварах плодов рябины, шиповника, боярышника и настое плодов малины) основными антиоксидантами являются антиоксиданты средней силы, в том числе флавоноиды, и слабой силы (токоферол и др.). На основе уменьшения светосуммы хемилюминесценции была рассчитана общая антиоксидантная емкость для изученных объектов. Сравнение полученных значений ОАЕ с результатами химического анализа показало, что продукты, содержащие одно и то же количество антиоксидантов с разным их соотношением, могут различаться по своей способности эффективно защищать организм от вредного воздействия свободных радикалов. Описанная методика перспективна для изучения растительных объектов, в которых содержится смесь различных антиоксидантов. При этом она отличается простотой и невысокой стоимостью исследования. Сочетание измерения кинетики хемилюминесценции с математическим моделированием реакций позволит не только автоматизировать процесс определения ОАЕ, но и определять вклад отдельных групп антиоксидантов в показатель.

АнтиОксиданты (АО) - вещества, препятствующие окислению. В живом организме ведущим фактором окисления является образование свободных радикалов, поэтому действие антиоксидантов в биологических системах рассматривается преимущественно с позиции предотвращения окисления органических веществ свободными радикалами.

В настоящее время существует большое количество различных методов определения антиоксидантов: фотометрические, химические, электрохимические и др. Однако, многие из них имеют существенные недостатки, затрудняющие понимание и дальнейшее использование результатов, полученных этими методами. К наиболее часто встречающимся недостаткам можно отнести следующие:

• Используются искусственные или нехарактерные для биологических систем условия измерения антиоксидантного действия. Например, вместо биологических свободно-радикальных реакций используются чисто химические окислительно-восстановительные реакции или осуществляется измерение способности вещества отдавать/принимать электроны при воздействии электрическим током. Результаты измерений, полученные в таких условиях, не позволяют говорить о том, исследуемое вещество будет проявлять такое же "антиоксидантное" действие в организме.
• Определение антиоксидантного действия осуществляется путем измерения количества накопленных продуктов окисления (маркеров окисления). Таким образом действительно можно определить количество антиоксиданта в исследуемом образце, но упускается весьма важная информация об активности антиоксиданта. Игнорирование активности антиоксиданта в свою очередь может приводить к существенным ошибкам в определении его количества, например, для "слабых" антиоксидантов, которые действуют медленно, но в течение длительного времени.

Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным методом исследования антиоксидантов и обладает рядом существенных преимуществ:

1. Прямое определение антиоксидантного действия - регистрируется непосредственное действие антиоксидантов на свободные радикалы. В хемилюминесцентном методе используется химическая система генерации свободных радикалов, которая дает контрольное хемилюминесцентное свечение. Затем к такой системе добавляется антиоксидант, который нейтрализует свободные радикалы, что приводит к подавлению контрольной хемилюминесценции.
   Значительным достоинством такого подхода является возможность использования различных химических систем генерации свободных радикалов, что позволяет дополнительно определять специфичность антиоксидантов и локализацию их действия.
2. Измерение количественных и качественных характеристик антиоксидантов - хемилюминесцентный метод позволяет охарактеризовать любое соединение, обладающее антиоксидантным действием, двумя независимыми показателями:
   • АнтиОксидантная Емкость (АОE) - общее количество свободных радикалов, которое может нейтрализовать соединение, содержащееся в пробе определенного объема.
   • АнтиОксидантная Активность (АОА) - скорость нейтрализации свободных радикалов, т.е. количество радикалов, нейтрализуемых в единицу времени.

Хемилюминесцентный метод дает важное понимание того, что действие антиоксидантов обязательно должно оцениваться двумя показателями - количественным (AOE) и качественным (AOA).
Следующий рисунок демонстрирует это положение:

Влияние разных антиоксидантов на хемилюминесценцию
(цифрами возле графиков указана концентрация антиоксиданта):
слева – "сильный" антиоксидант, справа – "слабый" антиоксидант.

Антиоксиданты существенно отличаются своей активностью. Существуют "сильные" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с высокой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с высокой скоростью и полностью подавляют хемилюминесценцию. Такие антиоксиданты оказывают максимальный эффект уже при малых концентрациях и быстро расходуются. С другой стороны существуют "слабые" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с низкой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с низкой скоростью и подавляют хемилюминесценцию лишь частично. Значимый эффект такие антиоксиданты оказывают только в больших концентрациях, но при этом они медленно расходуются и действуют в течение длительного времени.

Хемилюминесцентный метод может применяться для определения антиоксидантных показателей:

• биологических жидкостей (плазма, слюна, моча);
• фармакологических препаратов и биологически активных добавок;
• напитков и пищевых добавок;
• косметических средств и средств для ухода;
• и др.

• Хемилюминометр Lum-100 - обеспечивает термостатирование и регистрацию хемилюминесценции 1 пробы.
• Хемилюминометр Lum-1200 - обеспечивает термостатирование и одновременную регистрацию хемилюминесценции до 12 проб.

Нажав на кнопку "Скачать архив", вы скачаете нужный вам файл совершенно бесплатно.
Перед скачиванием данного файла вспомните о тех хороших рефератах, контрольных, курсовых, дипломных работах, статьях и других документах, которые лежат невостребованными в вашем компьютере. Это ваш труд, он должен участвовать в развитии общества и приносить пользу людям. Найдите эти работы и отправьте в базу знаний.
Мы и все студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будем вам очень благодарны.

Чтобы скачать архив с документом, в поле, расположенное ниже, впишите пятизначное число и нажмите кнопку "Скачать архив"

Подобные документы

Исследование ферментативных и неферментативных путей образования активных форм кислорода. Механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности, инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Антиоксидантная защита организма.

курсовая работа , добавлен 11.01.2017


Антиоксидантная активность растительных материалов. Описание растений, обладающих антиоксидантной активностью. Определение содержания витамина С в калине обыкновенной в период созревания, содержания полифенольных соединений в различных сортах чая.

дипломная работа , добавлен 02.04.2009


Гиббереллины - обширный класс фитогормонов, регулирующих рост и развитие: история открытия, химическая структура, классификация, содержание в растениях. Биохимия, регуляторные функции и биологическая активность гиббереллинов, их строение, свойства.

презентация , добавлен 20.10.2014


реферат , добавлен 19.05.2017


Биологическая активность и химическая структура брассиностероидов. Синтезы с сохранением углеродного скелета. Формирование функций характерных для циклической части брассиностероидов. Построение боковой цепи с образованием новых углерод-углеродных связей.

курсовая работа , добавлен 07.12.2014


Исследование физиологии поджелудочной железы, роли панкреатического сока в процессе пищеварения. Анализ активных форм кислорода и путей их образования, биохимии свободно-радикальных процессов. Обзор состояния обменных процессов при остром панкреатите.

курсовая работа , добавлен 10.03.2012


Химический состав рода Penstemon и биологическая активность. Качественный фитохимический анализ растительного сырья методом тонкослойной хроматографии. Определение количественного состава компонентов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

практическая работа , добавлен 07.01.2016

дипломная работа

1.4 Методы исследования антиоксидантов

антиоксидантной активности классифицируются: по способам регистрации проявляемой АОА (волюмометрические, фотометрические, хемилюминесцентные, флуоресцентные, электрохимические); по типу источника окисления; по типу окисляемого соединения; по способу измерения окисленного соединения.

Однако наиболее известными методами определения антиоксидантной активности являются:

1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод основан на следующей реакции:

Метмиоглобин + Н 2 О 2 >Феррилглобин +ABTS>ABTS*+АО.

Метод определения эквивалентов Тролокса (TEAC) основан на способности антиоксидантов восстанавливать радикальные катионы 2,2-азинобиса (ABTS) и тем самым ингибировать поглощение в длинноволновой части спектра (600 нм). Существенным недостатком метода является двухступенчатая реакция получения радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс результатов, несмотря на то, что для анализа используют стандартизированный набор реактивов .

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод основан на следующей реакции:

Fe(III)-Трипиридитриазин+АО>Fe(II)-Трипиридилтриазин.

Железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (FRAP). Здесь используется реакция восстановления Fe(III)-трипиридилтриазина до Fe(II)-трипиридилтриазина . Однако этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например глутатиона. Этот метод позволяет прямое определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивно голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси. Этот метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.

3 ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод основан на следующей реакции:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Люминол.

Определение способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC). В этом методе регистрируют флуоресценцию субстрата (фикоэритрина или флуоресцеина), которая возникает в результате его взаимодействия с АФК. Если в исследуемом образце есть антиоксиданты, то наблюдают уменьшение флуоресценции по сравнению с контрольным образцом . Первоначально этот метод был разработан доктором Гохуа Као в Национальном институте старения в 1992 г. В 1996 году доктор Као объединился с доктором Рональдом Прайером в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA, где был создан полуавтоматический метод .

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) : метод основан на следующей реакции:

AAPH+AO>AAPH* + ФЛ (ФЭ).

В этом методе используют способность антиоксидантов взаимодействовать с пероксильным радикалом 2,2- азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (ААРН). Модификации TRAP состоят в способах регистрации аналитического сигнала. Чаще всего на завершающей стадии анализа перокси-радикал ААРН взаимодействует с люминисцирующим (люминол), флуоресцирующим (дихлорфлюоресцин-диацетат, DCFH-DA) или другим оптически активным субстратом.

В качестве стандарта для методов TEAC, ORAC и TRAP используют водорастворимое производное витамина Е - Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).

В последнее время для оценки антиоксидантной активности возрос интерес к применению электрохимических методов. Эти методы обладают высокой чувствительностью, быстротой анализа.

Оценку антиоксидантной активности некоторых пищевых продуктов проводят методом потенциометрии, основанном на использование свойства веществ-антиоксидантов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях за счет енольных (-ОН) и сульфгидрильных (-SH) групп.

Определение антиоксидантных свойств растворов основано на химическом взаимодействии антиоксидантов с медиаторной системой, которое приводит к изменению ее окислительно-восстановительного потенциала. Электрохимическая ячейка представляет собой емкость, содержащую K-Na-фостфатный буферный раствор, медиаторную систему Fe(III)/Fe(II) и комплексный электрод до измерения окислительно-восстановительного потенциала. Антиоксидантную активность оценивают в г-экв/л.

Амперометрический метод определения антиоксидантной активности основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом. Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенном к нему. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов,при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. К недостаткам способа можно отнести его специфичность: в данных условиях не могут быть проанализированы антиоксиданты, которые сами окисляются или восстанавливаются в области потенциалов электровосстановления кислорода. К достоинствам способа можно отнести его экспрессность, простату и чувствительность .

Метод гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных окислителей - метод применим для анализа жирорастворимых антиоксидантов .

Разработаны различные способы определения аскорбиновой кислоты:

амперометрический способ с использованием алюминиевого электрода, модифицированного пленкой гексацианоферрата никеля (II), методом простого погружения в раствор;

способ твердофазно-спектрофотометрического и визуального тест-определения аскорбиновой кислоты с использованием в качестве индикаторного порошка ксерогеля кремниевой кислоты, модифицированного реактивом Вавеле и медью (II);

хемилюминесцентное определение аскорбиновой кислоты можно провести проточно-инжекционным методом по хемилюминесцентной реакции родамина В с церием (IV) в сернокислой среде .

определение аскорбиновой кислоты в диапазоне 10 -8 -10 -3 г/см 3 методом анодной вольтамперометрии в водных и водно-органических средах.

Наиболее распространенным является метод FRAP, так как он экспрессен, высокочувствителен. За последние несколько десятилетий было разработано большое количество разновидностей методик определения антиоксидантной активности методом FRAP(таблица 1).

Таблица 1 Развитие метода FRAP и его применение для определения антиоксидантной активности разных объектов

Примечания: условно обозначено: ПИА-проточно-инжекционный анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2 , -дипиридил, PHEN-о-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоновая кислота, FZ-феррозин, АК-аскорбиновая кислота, КТ-катехол, t-время экспозиции, мин.

Взаимодействие между белками и полиэлектролитами в водных растворах

Для характеристики белок-полиэлктролитных комплексов используют различные методы анализа. Инструментальные методы дают информацию по структурным и оптическим свойствам, а также определяют динамику и характер связывания ПЭК...

Влияние соединений d-металлов на скорость диссоциации молекулы воды в биполярной мембране

В процессе синтеза новых БПМ большое внимание должно быть уделено исследованию свойств полученных образцов для последующего выбора условий синтеза, обеспечивающих улучшение электрохимических характеристик синтезируемых мембран...

Дизайнерские наркотики и синтетические каннабиноиды

Обнаружение синтетических каннабиноидов в растительных смесях может быть осуществлено различными физико-химическими методами, такими как хромато-масс-спектрометрия, газовая, тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматографии...

Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

Синтез и фармакологические свойства хинолинонов-2

Объект исследования: Хинолинон-2. Метод исследования: С помощью компьютерной программы «Marvin JS», была создана структура вещества. Далее она была отправлена сайт «http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php» для дальнейшего исследования...

Термоспектральный метод исследования продуктов испарения эпоксидного полимера

Технология получения высокоочищенного хитозана из панцирей ракообразных

Определение молекулярной массы хитозана Молекулярную массу хитозана определяли вискозиметрически по стандартной методике. Растворы концентрации 0,05 и 0,5 г/дл готовили растворением навески порошка полимера в ацетатном буфере (0...

Физико-географическая характеристика территории природного парка

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при определении суммарной антиоксидантной активности. Способ осуществляют следующим образом: аналит взаимодействует с реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин. Аскорбиновая кислота (АК) взаимодействует с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100. Далее инкубируют не менее 90 мин и фотометрируют при 510±20 нм. После этого устанавливают зависимость величины аналитического сигнала от количества вещества и расчитывают величину суммарной АОА. Представленный способ позволяет менее трудоемко и более достоверно определять суммарную антиоксидантную активность растительного сырья и пищевых продуктов на его основе. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано при определении суммарной антиоксидантной активности (АОА) растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.

Известен кулонометрический способ определения суммарной АОА чая, основанный на взаимодействии водных экстрактов продукта с электрогенерируемыми соединениями брома (И.Ф.Абдулин, Е.Н.Турова, Г.К.Будников Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерируемым бромом // Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. № 6. С.627-629). Выбор в качестве титранта электрогенерированных соединений брома обусловлен их способностью вступать в различные реакции: радикальные, окислительно-восстановительные, электрофильного замещения и присоединения по кратным связям. Это позволяет охватить широкий круг биологически активных соединений чая, обладающих антиоксидантными свойствами. Недостатками способа являются возможность протекания реакции бромирования с веществами, не являющимися антиоксидантами, и выражение получаемой величины суммарной АОА в единицах количества электричества (кКл/100 г), что затрудняет оценку получаемых результатов.

Известен вольтамперометрический способ определения суммарной антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0,0 до -0,6 В (отн. насыщ. х.с.э.) на ртутно-пленочном электроде (Пат. 2224997, Россия, МПК 7 G 01 N 33/01. Вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов / Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А. - № 2002115232/12; заявл. 06.06.2002; опубл. 27.02.2004). Недостаток способа - в протекании побочных электрохимических реакций, в результате которых снижается эффективность определения антиоксидантов, что ведет к снижению достоверности результатов.

Известен способ контроля суммарной АОА профилактических и лечебных антиоксидантных средств по перекисному окислению липидов до малонового альдегида с спектрофотометрическим или хемилюминесцентным детектированием (Пат. 2182706, Россия, МПК 7 G 01 N 33/15, 33/52. Способ контроля антиокислительной активности профилактических и лечебных антиоксидантных средств / Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. - № 2001101389/14; заявл. 15.01.2001; опубл. 20.05.2002). При этом антиоксидантная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов. Недостатком данного способа можно считать ограниченный круг анализируемых объектов, так как в данных условиях определяются антиоксиданты только одной группы - липиды.

Известен способ определения суммарной АОА экстракта растений, заключающийся в инкубации экстракта с линетолом и сульфатом железа (II), инициировании реакции окисления УФ-облучением и последующем взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой в присутствии тритона Х-100 (Заявка 97111917/13, Россия, МПК 6 G 01 N 33/00. Способ определения общей антиокислительной активности / Рогожин В.В. - Заявл. 08.07.1997; опубл. 10.06.1999). При проведении спектрофотометрирования используется смесь этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Значение АОА биологического материала определяют по отношению накопления продукта реакции - малонового диальдегида в пробе, содержащей экстракт, к пробе с прооксидантом. Недостаток способа заключается в возможности протекания побочных реакций при УФ-облучении, что снижает достоверность получаемых результатов анализа.

Перечисленные способы определения суммарной АОА имеют ряд недостатков: высокая трудоемкость, малая достоверность, измеренная величина суммарной АОА не отнесена и не сравнима с каким-либо общепринятым веществом.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ определения суммарной АОА лекарственных растений измерением хемилюминесценции, возникающей при реакции с люминолом в присутствии окислителя пероксида водорода (М.Х.Навас, А.М.Химинец, А.Г.Асуэро Определение восстановительной способности настоек семени канарского канареечника методом хемилюминесценции // Журн. аналит. химии. 2004. Т.59. № 1. С.84-86). Для количественной оценки суммарной АОА сравнивали восстановительную способность экстракта лекарственного сырья и активность сильнодействующего антиоксиданта - аскорбиновой кислоты в количестве 25-110 мкг. По сравнению с перечисленными способами в прототипе в качестве окислителя применяют пероксид водорода, взаимодействующий с широким кругом антиоксидантов, и измеренная величина суммарной АОА объекта определяется и выражается относительно аскорбиновой кислоты, являющейся общепринятым антиоксидантом, что позволяет получать достоверные результаты при сохранении остальных недостатков. К недостаткам также следует отнести и сложность применяемого в способе оборудования.

Технической задачей заявленного изобретения является разработка менее трудоемкого и достоверного способа определения суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.

Для решения технической задачи предлагается взаимодействие аналита с реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин, и аскорбиновой кислоты (АК) с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100, инкубируют не менее 90 мин, фотометрируют при 510±20 нм с последующим установлением зависимости величины аналитического сигнала от количества вещества и расчетом величины суммарной АОА. В частности, расчет можно осуществить по формуле (I), выведенной из уравнения количественного соответствия между исследуемым объектом и аскорбиновой кислотой:

где а, в - коэффициенты в уравнении регрессии для зависимости аналитического сигнала от количества АК;

а", в" - коэффициенты в уравнении регрессии для зависимости аналитического сигнала от количества исследуемого объекта;

х вос. - масса исследуемого восстановителя (образца), мг.

Использование предлагаемого реагента в указанных условиях позволило расширить линейный диапазон и снизить нижнюю границу определяемых количеств аскорбиновой кислоты. Предлагаемая совокупность существенных признаков позволяет определять суммарную АОА широкого круга растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.

Уравнения количественного соответствия связывает зависимость аналитического сигнала от количества аскорбиновой кислоты и зависимость аналитического сигнала от количества исследуемого объекта при условии равной антиоксидантной активности.

После обработки результатов фотометрических измерений величины аналитического сигнала методом наименьших квадратов (К.Дерффель Статистика в аналитической химии. - М.: «Мир», 1994. С.164-169; А.К.Чарыков Математическая обработка результатов химического анализа - Л.: Химия, 1984. С.137-144) указанные зависимости были описаны линейной регрессионной функцией: y=ax+b, где а - коэффициент регрессии, b - свободный член. Коэффициент а в уравнении регрессии равен тангенсу угла наклона прямой к оси х; коэффициент b - расстоянию по оси у от начала координат (0,0) до первой точки (x 1 , y 1).

Коэффициенты а и b рассчитываются по формулам:

Уравнение регрессии для зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты в данный момент времени имеет вид:

у АК =а·х АК (мг)+b,

уравнение регрессии для зависимости АС от количества исследуемого объекта (восстановителя):

у ВОСТ =а"·х ВОСТ (мг)+b",

где у АК, у ВОСТ - оптическая плотность фотометрируемого раствора;

х АК (мг), х ВОСТ (мг) - концентрация аскорбиновой кислоты (восстановителя) в растворе;

тогда, приравнивая значения функций, получаем формулу (I) для расчета антиоксидантной активности исследуемого объекта в единицах количества (мг) аскорбиновой кислоты.

На чертеже отражена зависимость аналитического сигнала от количества восстановителя.

Измерение оптической плотности анализируемых растворов проводили на фотоэлектроколориметре КФК-2МП.

Известно (Ф.Умланд, А.Ясин, Д.Тирик, Г.Вюнш Комплексные соединения в аналитической химии - М.: Мир, 1975. - 531 с.), что о-фенантролин образует с железом(II) растворимый в воде хелат красно-оранжевого цвета, который характеризуется максимумом поглощения при λ=512 нм. Поэтому в предлагаемом способе фотометрирование проводят при λ=510±20 нм.

Оптимизацию состава реагента и его количества, вводимого в реакцию, проводили на основании результатов многофакторного планирования эксперимента методом «Латинского квадрата», которое заключалось в изменении в каждом опыте всех изучаемых факторов, причем каждый уровень каждого фактора только один раз встречается с различными уровнями других факторов. Это позволяет выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности.

В качестве факторов выступали: количества Fe(III), о-фенантролина и объем реагента, вводимого в реакцию. Совокупность факторов должна обеспечивать широкий диапазон линейности аналитического сигнала (АС) при достаточной чувствительности, с одной стороны, и устойчивости реагента во времени, с другой. Это позволило для каждого фактора выделить следующие уровни:

количество Fe(III): 0,003 М (A 1); 0,006 М (А 2); 0,009 М (А 3);

количество о-фенантролина: 0,01 M (B 1); 0,02 М (В 2); 0,03 М (В 3);

объем реагента: 0,5 мл (C 1); 1,0 мл (С 2); 2,0 мл (С 3) (таблица 1).

Для выбора оптимальной комбинации уровней факторов получали градуировочные зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты в диапазоне от 10 до 150 мкг (что необходимо для подтверждения линейности функции), рассчитывали уравнение регрессии полученной зависимости, а затем величину АС при заданном количестве (120 мкг) аскорбиновой кислоты. Таким образом, для каждого состава реагента (факторы А, В) был подобран объем (фактор С), при котором значение АС максимально. Это позволило сократить число рассматриваемых комбинаций до девяти (таблица 2).

Сравнивая, суммарный АС для каждого уровня выделили суммы, имеющие максимальное значение: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ΣC 2 (1,361). Это позволило заключить, что оптимальным является реагент состава: 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролина при его объеме, вводимом в реакцию, 1,0 мл на 100 мл раствора.

При оптимальной концентрации реагента изучили изменение зависимости АС от концентрации аскорбиновой кислоты и некоторых восстановителей, распространенных в природных объектах (танин, рутин, кверцетин), при различном времени инкубирования реакционной смеси (30, 60, 90, 120 мин). Было установлено, что для всех изучаемых восстановителей зависимость АС от их содержания линейна в диапазоне 10-150 мкг (см. чертеж) и величина АС зависит от времени инкубирования (таблица 3).

Из чертежа видно, что изменение АС под действием рутина незначительно, танина приближается, а кверцетина превосходит аналогичную зависимость для аскорбиновой кислоты. При рассмотрении изменения АС от времени инкубирования для всех изучаемых восстановителей (таблица 3) установлено, что стабилизация аналитического сигнала во времени наблюдается от 90 минут.

Для доказательства суммирующего характера определяемой величины АОА было изучено влияние реагента Fe (III) - о-фенантролин на модельные растворы, в состав которых входили восстановители: танин, рутин, кверцетин и аскорбиновая кислота в различных соотношениях. В таблице 4 представлены результаты анализа модельных смесей.

Расчет теоретической величины суммарной АОА проводили по уравнениям количественного соответствия, характеризующим антиоксидантную способность исследуемого восстановителя по отношению к аскорбиновой кислоте, при условиях равной антиоксидантной активности: .

Величину экспериментальной (найденной) АОА рассчитывали по усредненному уравнению регрессии для зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты. Из результатов, представленных в таблице 4, видно, что экспериментально полученные величины АОА удовлетворительно согласуются с теоретически рассчитанными.

Таким образом, определяемая величина АОА является суммарным показателем, а определение ее величины с использованием уравнений количественного соответствия является правильным.

Предлагаемый способ апробирован на реальных образцах. Для определения суммарной АОА реального образца или его экстракта получали градуировочные зависимости АС от количества аналита и аскорбиновой кислоты при времени инкубирования реакционной смеси не менее 90 минут. Расчет суммарной АОА проводили по формуле (I) и выражали в мг аскорбиновой кислоты на грамм исследуемого объекта (мгАК/г).

Для подтверждения правильности предлагаемого способа эти образцы испытывали по известным методикам, оценивая содержание аскорбиновой кислоты (ГОСТ 24556-89 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С) и преобладающих восстановителей: в чае - танина (ГОСТ 19885-74 Чай. Методы определения содержания танина и кофеина), в плодах шиповника - сумму органических кислот (ГОСТ 1994-93 Плоды шиповника. Технические условия) (таблица 5).